p–ISSN: 2723 - 6609 e-ISSN : 2745-5254
Vol. 4, No. 4, April 2023 http://jist.publikasiindonesia.id/
Doi : 10.59141/jist.v4i4.613 497
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan
Eucheuma Cottonii Untuk Mencari Gen Penyandi
Κ-Karaginase
Zahrotun Nafisah
1*
, Afaf Baktir
2
, Zimon Pereiz
3
Universitas Palangka Raya Kalimantan, Indonesia
1,3
Universitas Airlangga Surabaya, Indonesia
2
Email: [email protected]
*Correspondence
INFO ARTIKEL
ABSTRAK
Diterima
: 27-04-2023
Direvisi
: 29-04-2023
Disetujui
: 30-04-2023
κ-Karaginan adalah koloid hidrofilik yang diekstrak dari makroalga
Eucheuma cottonii. κ-karaginan mempunyai berat molekul yang sangat
besar sehingga pemanfaatannya terbatas. Namun, dalam bentuk
Carrageenan Oligosaccharide (COs), κ-karaginan mempunyai aktivitas
fisik dan biologi yang bervariasi, termasuk anti tumor, anti oksidan dan
anti angiogenik. Enzim κ-karaginase berperan memutus ikatan β-(1,4)
pada κ-karaginan untuk menghasilkan κ-COs (κ-carrageenan
oligosaccharide). Ada berbagai macam bakteri yang hidup di
permukaan Eucheuma cottonii, namun hanya ada 1% bakteri yang
dapat dikultur. Metode alternatif untuk eksplorasi bakteri di alam
adalah metode metagenomik. Dalam penelitian ini dilakukan eksplorasi
gen κ-karaginase dari DNA metagenom prokariot yang menempel di
permukaan Eucheuma cottonii. Konstruksi pustaka metagenom
prokariot dilakukan terhadap kumpulan fragmen DNA hasil digesti
dengan enzim restriksi SfiI. Kemudian fragmen DNA diligasi dengan
fag λTriplEx2 dan dilakukan penentuan titer. Titer tertinggi didapatkan
dari campuran ligasi dengan perbandingan DNA dan fag yaitu 3:2
sebesar 10,3 x 107. Kemudian plak positif diekspresikan melalui E.coli
BM25,8 untuk mencari gen penyandi enzim κ-karaginase. Aktivitas
positif enzim κ-karaginase ditandai dengan terbentuknya daerah halo.
Kemudian klon rekombinan yang membentuk halo dikultivasi untuk
produksi enzim κ-karaginase, dan diuji aktivitasnya untuk menentukan
suhu dan pH optimum. Berdasarkan uji aktivitas ekstrak κ-karaginase
terhadap suhu dan pH didapatkan 4 profil suhu dan pH optimum yang
berbeda, dengan demikian telah didapatkan 4 macam gen penyandi
enzim κ-karaginase.
ABSTRACT
κ-Carrageenan is a hydrophilic colloid extracted from the macroalga
Eucheuma cottonii. κ-carageenan has a very large molecular weight so
its utilization is limited. However, in the form of Carrageenan
Oligosaccharide (COs), κ-carrageenan has varied physical and
biological activities, including anti-tumor, anti-oxidant and anti-
angiogenic. The enzyme κ-carrageinase breaks the β-(1,4) bond in κ-
carrageenan to produce κ-COs (κ-carrageenan oligosaccharide).
There is a wide variety of bacteria living on the surface of Eucheuma
cottonii, but only 1% of bacteria can be cultured. An alternative
method for the exploration of bacteria in nature is the metagenomic
method. In this study, the κ-carcinase gene was explored from the DNA
of the prokaryotic metagenome attached to the surface of Eucheuma
cottonii. Construction of prokaryotic metagenome library was
performed on a collection of DNA fragments digested with SfiI
restriction enzyme. Then, the DNA fragments were ligated with
Kata kunci: κ-karaginase;
Eucheuma cottonii;
metagenomik.
Keywords: κ-caraginas;,
Eucheuma cottonii;
metagenomics.
Zahrotun Nafisah, Afaf Baktir, Zimon Pereiz
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 498
λTriplEx2 phage and the titer was determined. The highest titer was
obtained from the ligation mixture with a DNA and phage ratio of 3:2
of 10.3 x 107. Then the positive plaque was expressed through E.coli
BM25.8 to find the gene encoding κ-carcinase enzyme. The positive
activity of κ-carcinase enzyme was characterized by the formation of
halo region. Then the recombinant clone that formed the halo was
cultivated for κ-caraginase enzyme production, and tested for activity
to determine the optimum temperature and pH. Based on the activity
test of κ-caraginase extract against temperature and pH, 4 different
optimum temperature and pH profiles were obtained, thus 4 kinds of
genes encoding κ-caraginase enzyme have been obtained.
Attribution-ShareAlike 4.0 International
Pendahuluan
Eucheuma cottonii merupakan salah satu Carragaenaphyces, yaitu makroalga
penghasil karaginan. Kadar karaginan dalam setiap spesies Eucheuma berkisar antara
54% 73% tergantung pada jenis dan lokasinya (Wibowo, 2013). Di Indonesia kadar
karaginan makroalga jenis Eucheuma berkisar antara 61,5 % - 67,5 %.
Karaginan adalah polimer galaktosa sulfat rantai lurus yang diekstrak dari
Eucheuma cottonii dan merupakan sumber karbon penting bagi mikrobiota perairan
heterotropik (Prabha, Vasuki, KayalVizhi, & Manikandan, 2018). Karaginan merupakan
koloid hidrofilik, substansi yang bila berinteraksi dengan air akan membentuk sistem
koloid (Chauhan & Saxena, 2016). Koloid hidrofilik sangat penting karena keunikan
susunan fisik dan kimianya sehingga banyak digunakan di berbagai bidang bioteknologi
industri (Xiao et al., 2016).
Akibat ukuran molekul κ-karaginan yang besar dan kemampuannya yang rendah
dalam menembus jaringan menyebabkan aplikasinya terbatasi. Dalam bentuk
oligosakaridanya yaitu Carrageeenan Oligosaccharides (COs), mempunyai aktivitas
fisik dan biologi yang bervariasi, termasuk anti tumor, anti oksidan, dan anti
angiogenik. Dibandingkan dengan ι- dan λ-COs, κ-COs mempunyai aktivitas
antioksidan yang paling tinggi (Zhu, Ni, Ning, Yao, & Du, 2018). Enzim κ- karaginase
berperan dalam memutus ikatan β-(1-4) pada κ-karaginan untuk menghasilkan κ-COs
(Chauhan & Saxena, 2016).
Pada 2017, Kawaroe menjelaskan bahwa banyak mikrobiota yang dapat
mendegradasi dinding sel makroalga. Namun selama ini hanya ada 1% dari jumlah
keseluruhan bakteri yang dapat dikultur (cultivable) di dalam laboraturium.
Metagenomik digunakan untuk isolasi DNA total bakteri dari sampel alam. Sehingga
dapat mengetahui karakter bakteri dan kelimpahannya, serta ekspresi gen bakteri
uncultivable dapat dilakukan (Nam et al., 2018). Efisiensi hasil konstruksi pustaka
metagenom dinyatakan dalam titering. Titering dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti
efisiensi ligasi, digesti dan transformasi. Keberhasilan konstruksi pustaka metagenomik
apabila jumlah titer di atas standar minimal yaitu 1,7 x 105 (Fitriyah, 2017).
Dalam penelitian ini akan dilakukan eksplorasi gen penyandi enzim κ- karaginase
yang didapat dari isolasi DNA metagenom prokariotik dari sampel permukaan
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan Eucheuma Cottonii Untuk Mencari
Gen Penyandi Κ-Karaginase
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 499
Eucheuma cottonii. Kelebihan dan keuntungan Eucheuma cottonii merupakan sumber
κ-karaginan yang melimpah sehingga diharapkan bakteri yang terdapat gen penyandi
enzim κ- karaginase ada di sana (Kawaroe, Pratiwi, & Sunudin, 2017).
Metode Penelitian
Isolasi DNA Metagenom Prokariot
Sampel DNA metagenom berupa makroalga Eucheuma cottonii yang diambil dari
laut Madura. Untuk mendapatkan sampel prokariot maka dilakkan penyaringan dengan
membran berukuran 3µm dan diambil supernatan yang lolos, kemudian disaring lagi
menggunakan membran berukuran 0,2µm dan membran disuspensi dengan PBS. Isolasi
DNA metagenom menggunakan TIANamp Bacterial DNA Kit. Hasil isolasi DNA
metagenom prokariot divisualisasi dengan elektroforesis DNA.
Konstruksi Pustaka Metagenom
DNA metagenom hasil isolasi dilakukan digesti dengan enzim restriksi SfiI untuk
mendapatkan fragmen DNA. Proses digesti dilakukan pada suhu 50°C dan diinkubasi
selama 1, 2 dan 3 jam. Fragmen DNA yang diambil adalah fragmen DNA dengan
ukuran 2-10 kB. Fragmen DNA tersebut kemudian diligasi dengan vektor bakteriofag
λTriplEx2. Dilakukan optimasi komposisi campuran antara fragmen DNA metagenom
dan vektor untuk mendapatkan nilai titer yang tinggi. Komposisi campuran ligasi yang
digunakan antara DNA dan vektor adalah 1:2, 1:1 dan 3:2. Kemudian dilakukan
packaging in vitro untuk mendapatkan fag utuh. Tranduksi dilakukan ke dalam inang
E.coli XL-1Blue. Blue-white screening dalam media yang mengandung MgSO4
digunakan untuk memastikan adanya DNA insert dalam vektor.
Seleksi Klon Rekombinan dengan Aktivitas κ-Karaginase
24 plak putih dari analisis Blue-white screening diambil untuk ditransduksikan ke
dalam E.coli BM25,8 untuk dilakukan untuk menemukan aktivitas κ-karaginase. Media
yang digunakan adalah media LB padat yang mengandung 0,5% κ-karaginan, 0,05%
(NH4)2SO4 dan 0,001% FeCl3.
Karakterisasi Ekstrak κ-Karaginase
Klon rekombinan yang menghasilkan daerah halo dilakukan kultivasi untuk
produksi enzim κ-karaginase. Kultivasi dilakukan dengan melakukan shaking pada
media LB cair dengan kecepatan 200 rpm dan suhu 31°C sampai nilai OD600 adalah
2,1. Kemudian hasil inokulasi diambil 200 µl untuk dipindahkan di media produksi
berupa LB cair yang mengundung 0,1% κ- karaginan, 0,05% (NH4)2SO4 dan 0,001%
FeCl3. Shaking dilakukan selama 12 jam untuk kemudian ditambahkan IPTG sebesar
1%. Lalu dilakukan shaking lanjutan selama 6 jam. Hasil produksi disentrifugasi dengan
kecepatan 2.000 rpm selama 10 menit untuk mendapatkan pellet sel. Pellet sel
disuspensi dengan PBS dan dilakukan sonikasi selama 10 menit. Ekstrak κ- karaginase
diuji aktivitasnya dengan metode DNS pada suhu 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 dan 80°C.
Selain itu juga diuji aktivitasnya pada pH 4, 5, 6, 7, 8 dan 9. Buffer yang digunakan
untuk pH 4-7 adalah buffer fosfat sitrat, sedangkan pH 8-9 menggunakan buffer Tris-
HCl.
Zahrotun Nafisah, Afaf Baktir, Zimon Pereiz
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 500
Hasil dan Pembahasan
Isolasi DNA Metagenom Prokariot
Penyaringan dengan membran ukuran 3µm dan 0,2µm berfungai untuk
mendapatkan sampel prkariot karena ukuran prokariot berkisar antara 0,2 sampai 3µm.
Setelah didapatkan suspensi bakteri dalam buffer PBS, dilakukan pegukuran nilai
OD600 untuk memperkirakan jumlah sel bakteri. Nilai absorbansi didapatkan sebesar
0,0989. Syarat jumlah sel bakteri yang direkomendasikan kit adalah absorbansi 0,001 –
0,125. Hasil isolasi DNA metagenom divisualisasi dengan elektroforesis DNA (Gambar
1).
Metagenom hasil isolasi. Lane 1 dan 2 berturut-turut adalah DNA metagenom dari
hasil elusi pertama dan kedua
Gambar 1. Visualisasi DNA
1 2
Konstruksi Pustaka Metagenom
Hasil isolasi DNA metagenom didigesti dengan enzim SfiI. Visualisasi tiga
variasi waktu dapat dilihat pada Gambar 2. Enzim SfiI dipilih karena memiliki
kemampuan restriksi 8 pasang basa spesifik dan bersifat jarang memotong sehingga
mencegah terjadinya kemungkinan pemotongan gen target secara internal. Inkubasi
dilakukan pada suhu optimum enzim SfiI yaitu 50°C. Berdasarkan hasil digesti tersebut,
DNA dengan ukuran 2 kB – 10 kB diambil untuk disisipkan pada vektor λtriplEx2.
Pemilihan panjang 2 kB – 10 kB berdasarkan kemampuan fag dalam menampung insert
sampai 13 kB (Zelvi, Suryani, & Setyaningsih, 2017).
Kemudian fragmen DNA metagenom yang didapatkan diligasi dengan vektor
λTriplEx2. Untuk tujuan optimalisasi ligasi, dilakukan 3 variasi ligasi dengan
perbandingan DNA dan vektor berturut- turut 1:2, 1:1 dan 3:2. Selain itu juga dibuat
kontrol positif menggunakan DNA insert dari Kit SMART library construction kit dan
kontrol negatif berupa E.coli tanpa insert (Gambar 3). Dari kedua kontrol tersebut dapat
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan Eucheuma Cottonii Untuk Mencari
Gen Penyandi Κ-Karaginase
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 501
dibedakan bentuk plak dan koloni bakteri E.coli. Plak berwarna putih dan warna putih
akan semakin jelas seiring berjalannya hari, sedangkan koloni E.coli diameternya akan
bertambah seiring berjalannya hari.
Produk ligasi perlu dilakukan packaging menjadi bakteriofag utuh. Produk
packaging diencerkan 1 : 1.000.000 yang bertujuan agar plak yang dihasilkan tidak
tumpang tindih atau menyatu sehingga memudahkan proses seleksi.
1 2 3 4 5
Gambar 2.
Elektroforesis fragmen DNA metagenom prokariot hasil digesti dengan enzim
restriksi SfiI A&B. Lane 1 : marker restriksi λ/HindIII. Lane 2, 3, 4 dan 5 adalah waktu
inkubasi proses digesti berturut-turut 0, 1, 2, dan 3 jam
1 2
Gambar 3.
Kontrol positif dan negatif untuk analisis blue-White Screening. A : kontrol
positif berupa bakteri E.coli XL-1Blue yang disisipi DNA insert dari Kit yang
Zahrotun Nafisah, Afaf Baktir, Zimon Pereiz
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 502
ditumbuhkan pada media LB/MgSO4 dengan IPTG dan X-Gal. B : kontrol negatif
berupa bakteri E.coli XL-1Blue yang ditumbuhkan pada media LB/MgSO4.
Untuk mengetahui inang manakah yang membawa fag dengan insert dan tanpa
insert, dilakukan seleksi dengan metode blue-white screening karena fag λTriplEx2
mengkode sintesis enzim β-galaktosidase (Buwono, 2017). Enzim β-galaktosidase akan
memecah substrat laktosa atau 5-bromo-4-kloro-3- indolilbeta-D-galaktopiranosid (X-
gal). Zat warna biru akan dilepas pada proses hidrolisis X-gal oleh β-galaktosidase
menjadi galaktosa dan 5.5’-dibromo-4.4’- dikloro-indigo. Dalam pengamatannya akan
terbentuk plak berwarna biru. Sedangkan fag dengan insert tidak akan dapat mengkode
enzim β-galaktosidase sehingga akan tampak plak berwarna putih.
A B
C
Gambar 4
Hasil ligasi pada 3 macam campuran ligasi. A, B dan C berturut-turut adalah
perbandingan jumlah DNA metagenom dan fag 1:2, 1:1 dan 2:3
Untuk mengetahui efisiensi ligasi, dilakukan penghitungan titer. Dihitung jumlah
plak yang terbentuk pada setiap komposisi campuran ligasi (Gambar 4). Hasil
perhitungan titer pada setiap komposisi campuran ligasi ada pada Tabel 1.
Tabel 1.
Hasil perhitungan titering 3 macam komposisi campuran ligasi
Campuran
Ligasi
Perbandingan
DNA dan fag
Titer (pfu/mL)*
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan Eucheuma Cottonii Untuk Mencari
Gen Penyandi Κ-Karaginase
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 503
I
1 : 2
192
𝑥
1.000.000
𝑥
10
3
= 9,6 x 10
7
2.000
II
1 : 1
107
𝑥
1.000.000
𝑥
10
3
= 5,35 x 10
7
2.000
III
3 : 2
206
𝑥
1.000.000
𝑥
10
3
= 10,3 x 10
7
2.000
*pfu/mL =
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑝𝑙𝑎𝑘 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 10
3
𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔
Seleksi Klon Rekombinan dengan Aktivitas κ-Karaginase
Dipilih 24 fag yang diambil dari hasil blue-white screening dan ditransduksikan
ke E.coli BM25.8. E.coli BM25.8 rekombinan akan dilakukan streak pada media LB
yang telah ditambahkan substrat berupa κ-karaginan. Enzim κ-karaginase akan
memotong polimer κ-karaginan menjadi κ-COS. Aktivitas κ-karaginase ditandai dengan
adanya daerah halo yang terbentuk (Gambar 5).
Gambar 5
Hasil screening menggunakan substrak κ-karaginase dengan pewarnaan congo red
1%. Panah hitam menunjukkan koloni dengan daerah halo sedangkan panah putih
menunjukkan koloni tanpa daerah halo. A merupakan koloni yang memiliki daerah halo
sedangkan B adalah koloni tanpa daerah halo
Karakterisasi Ekstrak κ-Karaginase
Karakterisasi ekstrak κ-karaginase ditentukan berdasarkan aktivitas ekstrak κ-
karaginase terhadap suhu dan pH. Ekstrak κ-karaginase didapat dari koloni yang
mengandung gen penyandi enzim κ- karaginase yang menghasilkan daerah halo.
B
Zahrotun Nafisah, Afaf Baktir, Zimon Pereiz
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 504
12
0
100
80
60
40
20
0
20
40
60
80
100
12
0
100
80
60
40
20
0
20
40
60
80
100
Diambil 4 koloni dengan daerah halo untuk mengamati perbedaan karakteristiknya.
Selanjutnya, masing-masing ekstrak κ- karaginase diberi nama ekstrak κ- karaginase A,
B, C dan D.
Aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang digunakan untuk
membebaskan 1µmol gula pereduksi. Pada setiap pengukuran aktivitas ekstrak κ-
karaginase digunakan kontrol berupa ekstrak κ-karaginase yang sudah didenaturasi
untuk menghitung adanya gula pereduksi yang masih tersisa pada ekstrak κ-karaginase.
Aktivitas diukur pada rentang suhu antara 10-80°C. Profil masing-masing aktivitas
relatif dari keempat ekstrak κ-karaginase dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6
Grafik profil suhu optimum ekstrak κ-karaginase dari klon A, B, C dan D
A B
Aktivitas relatif (%) Aktivitas relatif (%)
Suhu (°C) Suhu (°C)
C
Aktivitas relatif (%) Aktivitas relatif (%)
Suhu (°C) Suhu (°C)
Aktivitas ekstrak κ-karaginase A mengalami kenaikan pada rentang suhu 10-
40°C. Namun pada suhu 50°C sampai 80°C terjadi penurunan. Hal ini tidak jauh
120
100
80
60
40
20
0
20
40
60
80
100
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan Eucheuma Cottonii Untuk Mencari
Gen Penyandi Κ-Karaginase
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 505
15
0
100
50
0
0
5
10
150
100
50
0
0
5
10
150
100
50
0
0
5
10
berbeda dengan ekstrak κ-karaginase B dan C yang profilnya mirip dengan ekstrak κ-
karaginase A. Sedangkan pada ekstrak κ- karaginase D, aktivitas cenderung stabil pada
suhu rendah dan mengalami kenaikan yang signifikan pada suhu 40°C serta penurunan
pada tingkat suhu yang lebih tinggi. Namun, aktivitas ekstrak κ- karaginase D pada suhu
50°C masih mempunyai aktivitas di atas 80% sehingga bisa dikategorikan sebagai
enzim thermostabil. Keempat profil suhu optimum ekstrak κ-karaginase tersebut
menunjukkan pada suhu 40°C.
Sedangkan aktivitas ekstrak κ- karaginase terhadap pH diukur pada pH 4, 5, 6, 7,
8 dan 9. pH 4-7 menggunakan buffer sitrat-fosfat, sedangkan pH 8-9 menggunakan
buffer Tris HCl. Aktivitas relatif ekstrak κ-karaginase dalam berbagai variasi pH dapat
dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7.
Grafik profil pH optimum ekstrak κ-karaginase dari klon A, B, C dan D
A B
Aktivitas relatif (%) Aktivitas relatif (%)
Ph pH
C D
Aktivitas relatif (%) Aktivitas relatif (%)
pH pH
Ekstrak κ-karaginase A dan D mempunyai aktivitas optimum pada pH 8,
sedangkan ekstrak enzim κ-karaginase B dan C mempunyai aktivitas optimum pada pH
7. Keempat aktivitas ekstrak κ- karaginase cenderung mengalami kenaikan mulai pH 4
sampai pH 7. Suhu optimum keempat ekstrak karaginase adalah 40°C. pH optimum 2
Zahrotun Nafisah, Afaf Baktir, Zimon Pereiz
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 506
ekstrak κ-karaginase adalah 7, sedangkan 2 ekstrak κ-karaginase yang lain adalah 8.
Walaupun demikian, diketahui bahwa masing-masing ekstrak κ-karaginase mempunyai
profil yang berbeda. Berdasarkan hal tersebut, keempat ekstrak κ-karaginase berasal
dari gen yang berbeda.
Kesimpulan
Pustaka metagenom prokariot yang menempel pada permukaan Eucheuma
cottonii memberikan nilai titer 10,3 x 107, tergolong pustaka metagenom dengan titer
tinggi (high titer). Dari pustaka metagenom yang ada didapatkan 4 klon rekombinan
yang menunjukkan aktivitas κ-karaginase dengan profil suhu dan pH optimum yang
berbeda-beda.
Penelitian selanjutnya disarankan untuk dilakukan analisis SDS-PAGE dan
zimogram untuk memperkirakan berat molekul enzim κ-karaginase. Selain itu perlu
dilakukan isolasi plasmid rekombinan dan sekuensing gen untuk mengetahui urutan gen
penyandi enzim κ-karaginase. Eksplorasi lebih lanjut dari pustaka metagenom yang
telah didapat untuk mendapatkan gen-gen penyandi enzim yang lain.
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan Eucheuma Cottonii Untuk Mencari
Gen Penyandi Κ-Karaginase
Jurnal Indonesia Sosial Teknologi, Vol. 4, No. 4, April 2023 507
Bibliografi
Buwono, Ibnu Dwi. (2017). Buku Ajar Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan untuk
Perakitan Konstruksi Vektor Ekspresi Ikan Lele Transgenik. Deepublish.
Chauhan, Prakram Singh, & Saxena, Arunika. (2016). Bacterial carrageenases: an
overview of production and biotechnological applications. 3 Biotech, 6(2), 146.
Fitriyah, Umaya Rizka. (2017). Isolasi dan identifikasi molekuler bakteri endofit akar
mangrove Sonneratia alba penghasil enzim gelatinase. Universitas Brawijaya.
Kawaroe, M., Pratiwi, I., & Sunudin, A. (2017). Isolation and characterization of marine
bacteria from macroalgae Gracilaria salicornia and Gelidium latifolium on
agarolitic activity for bioethanol production. IOP Conference Series: Earth and
Environmental Science, 65(1), 12025. IOP Publishing.
Nam, Bo Hye, Jang, Jisung, Caetano-Anolles, Kelsey, Kim, Young Ok, Park, Jung
Youn, Sohn, Hawsun, Yoon, Sook Hee, Kim, Heebal, & Kwak, Woori. (2018).
Microbial community and functions associated with digestion of algal
polysaccharides in the visceral tract of Haliotis discus hannai: Insights from
metagenome and metatranscriptome analysis. Plos One, 13(10), e0205594.
Prabha, D. R. A. Lakshmi, Vasuki, A., KayalVizhi, R., & Manikandan, T. (2018).
Identification of Endophytic Bacteria From Murraya koenigii And Their L-
Asparaginase Activity.
Wibowo, Pascalis Danny Kristi. (2013). Variasi Karaginan (Eucheuma cottonii Doty)
pada Proses Pembuatan Bakso Daging Sapi dengan Bahan Pengawet Tanin dari
Pisang Kluthuk. UAJY.
Xiao, Anfeng, Xu, Caiyun, Lin, Yan, Ni, Hui, Zhu, Yanbing, & Cai, Huinong. (2016).
Preparation and characterization of κ-carrageenase immobilized onto magnetic iron
oxide nanoparticles. Electronic Journal of Biotechnology, 19, 1–7.
Zelvi, Mustika, Suryani, Ani, & Setyaningsih, Dwi. (2017). Hidrolisis Eucheuma
cottonii Dengan Enzim K-Karagenase Dalam Menghasilkan Gula Reduksi Untuk
Produksi Bioetanol. Jurnal Teknologi Industri Pertanian, 27(1).
Zhu, Benwei, Ni, Fang, Ning, Limin, Yao, Zhong, & Du, Yuguang. (2018). Cloning and
biochemical characterization of a novel κ-carrageenase from newly isolated marine
bacterium Pedobacter hainanensis NJ-02. International Journal of Biological
Macromolecules, 108, 1331–1338. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.11.040
